Aacción central del factor inductor de ovulación (OIF/NGF) presente en el plasma seminal de llamas

Abstract

ABSTRACT Mammals have been divided into two large groups according to the mechanisms of ovulation, spontaneous ovulators in which the hormonal stimulus of estradiol produced by a preovulatory follicle triggers the ovulatory process and induced or reflex ovulators, in which the physical stimulation of the penis during mating induce the ovulation process. Recent studies have demonstrated that seminal plasma of camelids contains a protein that has been chemically characterized as β-NGF and would be the main chemical compound responsible for inducing ovulation in llamas and alpacas. However, the effect of the physical stimulation of the penis during copulation on the ovulatory process has not yet been completely studied. On the other hand, it has been proposed that this protein, contained in the seminal plasma, is absorbed into the systemic circulation and access to the central level to activate the hormonal cascade related to the ovulatory process. Therefore, the purpose of the first part of this study (Chapter I) was to: a) Discriminate the potential effect of the sensory stimulus induced by the natural mating of the chemical stimulus induced by the seminal plasma in the induction of the ovulation in llamas. b) To determine the systemic concentrations of β-NGF and its potential association with the preovulatory LH surge. The second part of this study was to (Chapter II): c) Identify the distribution or localization of trkA, the high affinity receptor for β-NGF at the cellular level in the hypothalamic, pituitary, and circumventricular organs in the nervous system of llamas. For these purposes, female llamas with a growing preovulatory follicle (> 7 mm) were randomly assigned to four treatment groups: 1) Mating with an intact male (n = 7); 2) Mating with a urethostomized male (n = 6); 3) Intrauterine infused with 5 ml of seminal plasma (n = 6) or 4) infused with 5 ml phosphate buffered saline (n = 6, PBS, negative control. After treatment, the ovaries of each female were examined by transrectal ultrasonography every 12 hrs (Time 0 = treatment) until ovulation and at day 7 to confirm the presence of a CL. Blood samples were collected from the females every 15 minutes to determine LH concentrations by RIA (8 hour sampling) and β-NGF by ELISA (3 hour vi sampling). For the second part of this study, 3 females with preovulatory follicles> 7 mm were euthanized under anesthesia. The brains were collected fixed and processed with routine histological techniques to obtain samples for immunocytochemical and immunofluorescence studies. In the first part of this Study (Chapter I), it was found that ovulation occurs only in females that received a mating by a fertile male or were infused with seminal plasma and was preceded by a preovulatory LH surger, associated with a circulating increase of β-NGF. The above results demonstrate that llamas can be induced to ovulate by the seminal plasma in the absence of mating and that the act of copulation alone cannot trigger the ovulation process without the deposition of seminal plasma. In addition, these results demonstrated an association between increased systemic β-NGF and pre-ovulatory LH surge, a change that occurs readily after infusion of seminal plasma into the uterus, suggesting that β-NGF is crucial for ovulation induction in these species. In the second part of this study (Chapter II), we attempt to identify the potential binding sites of β-NGF to its specific receptor (trkA) in the region of the Medial basal hypothalamus, pituitary gland and the circumventricular organs of the encephalon of llama, using immunocytochemistry and immunofluorescence techniques. We observed the expression of trkA in close association with the distribution of kisspeptin and GnRH neurons in the medial basal hypothalamus, whose anatomical location corresponds mainly to the arcuate nucleus. On the other hand, a significant immunolocalization of β-NGF was detected in tanycytes in ME, where they are intermingled with abundant fibers of GnRH and kisspeptin neurons. These glial cells play an essential function of bidirectional transport of compounds between blood and CSF, and could constitute a pathway of β-NGF from the portal blood to the hypothalamic neurons that control the secretion of GnRH. In addition, the trkA receptor and its ligand (β-NGF) was identified at the level of the PCs. The presence of this receptor at the level of this CVO has not been documented vii previously and it could constitute a route for the transport of this neurotrophin to the ventricular environment. Finally, β-NGF and GnRH fibers were identified in the OVLT region, which also raise the possibility that b-NGF could to stimulate the initiation of the ovulatory cascade in llamas. Based on the results of this study we can conclude that ovulation is induced after the deposition of the seminal plasma in the uterus during copulation in llamas. β-NGF is the main responsible molecule for triggering the ovulatory cascade that once incorporated into the blood after copulation could reach potential sites of action by entering the region of the medial basal hypothalamus, through the plexus Choroid or middle eminence, or directly signaling to GnRH neurons at the level of the OVLT. Keywords: Ovulation inducing factor, β-NGF, trkA, hypothalamus, pituitary gland, circumventricular organs, llamas.

RESUMEN Desde el punto de vista del mecanismo de ovulación, los mamíferos han sido divididos en dos grandes grupos, los ovuladores espontáneos en los cuales el estímulo hormonal del estradiol producido por un folículo preovulatorio desencadena el proceso ovulatorio y los ovuladores inducidos o reflejos, en los cuales el estímulo físico del pene durante la monta sería el factor que gatilla este proceso. Diversas investigaciones recientes, utilizando como modelo de estudio los camélidos, han demostrado que el plasma seminal contiene una proteína que ha sido caracterizada químicamente como β-NGF y que sería la principal responsable de inducir el proceso de ovulación en estas especies. Sin embargo, aún no se ha podido descartar completamente el efecto del estímulo físico del pene durante la cópula en la induccion del proceso ovulatorio. Por otra parte, si se propone que esta proteína contenida en el plasma seminal es absorbida a la circulación sistémica y por esta vía accedería a los sitios de activación de la cascada hormonal que desencadenan el proceso ovulatorio, se desconocen las variaciones en sus concentración plasmáticas posterior a la monta y su relación con el incremento preovulatorio de LH y los posibles sitios de acceso y señalización en la región hipotálamo-hipofisiaria. Por lo tanto, el propósito de la primera parte de esta investigación (Capítulo I) fue: a) Discriminar el potencial efecto del estímulo sensorial inducido por la monta natural del estímulo químico inducido por el plasma seminal en la inducción de la ovulación en llamas. b) Determinar las concentraciones sistémicas de β-NGF y su potencial asociación con el alza preovulatoria de LH. Y en la segunda parte (Capitulo II), c) Identificar él (ó los) sitios de expresión del receptor de alta afinidad trkA a nivel celular en la región hipotalámica, hipofisiaria y de los órganos circunventriculares en el sistema nervioso de llamas. Para estos efectos, llamas hembras con un folículo preovulatorio en crecimiento (> 7 mm) fueron asignadas al azar a cuatro grupos de tratamiento: 1) Cubiertas con un macho intacto (n=7); 2) Cubiertas con un macho uretrostomizado (n=6); 3) Infusión intrauterina de 5 ml de plasma seminal (n=6) ó 4) Infusión intrauterina de 5 ml de fosfato buffer salino (n=6, PBS, control negativo). Después del tratamiento, los ovarios de cada hembra fueron examinados mediante ultrasonografía transrectal cada 12 hrs (Tiempo 0=tratamiento) iii hasta la ovulación y al día 7 para confirmar la presencia de un CL. Muestras de sangre fueron colectadas de las hembras cada 15 minutos para determinar la concentración plasmática de LH mediante RIA (8 horas de muestreo) y β-NGF mediante ELISA (3 horas de muestreo). Para la segunda parte de esta investigación, 3 hembras con folículo preovulatorio > 7 mm fueron eutanasiadas bajo anestesia. De ellas se colectaron sus encéfalos, los que luego fueron fijados y procesados con técnicas histológicas de rutina para obtención de muestras para estudios inmunocitoquímicos y de inmunofluorescencia. En la primera parte de esta investigación (Capítulo I), se estableció que la ovulación ocurre únicamente en las hembras que recibieron una monta por parte de un macho fértil o que fueron infundidas con plasma seminal y fue precedida por un alza preovulatoria de LH, asociado a un incremento circulante de β-NGF. Los resultados anteriores demuestran que, hembras llamas pueden ser inducidas a ovular por el plasma seminal en ausencia de cópula y que el acto de la cópula por sí sólo no puede desencadenar el proceso de ovulación sin el depósito del plasma seminal. Además, estos resultados demostraron una asociación entre el incremento de β-NGF sistémico y alza preovulatorio de LH, cambio que ocurre prontamente después del depósito de plasma seminal en el útero, sugiriendo que β-NGF es crucial para la inducción de ovulación en estas especies. En la segunda parte de esta investigación (Capítulo II), quisimos identificar los potenciales sitios de unión de β-NGF a su receptor específico (trkA) en la región del hipotálamo medio basal, glándula pituitaria y de los Órganos circunventriculares del encéfalo de llama, utilizando técnicas de inmunocitoquímica e inmunofluorescencia. Observamos la expresión de trkA en estrecha asociación con la distribución de neuronas kisspeptina y GnRH en el hipotálamo medio basal, cuya localización anatómica corresponde principalmente al núcleo arcuato. Por otra parte, se detectó una significativa inmunolocalización de β-NGF en los tanicitos en la EM, donde se entremezclan con abundantes fibras de neuronas GnRH y kisspeptina. Estas células gliales iv cumplen una función esencial de transporte bidireccional de compuestos entre la sangre y el LCR, por lo que podrían constituir una vía de acceso de β-NGF desde la sangre portal hacia las neuronas hipotalámicas que controlan la secreción de GnRH. Por otra parte, el receptor trkA y su ligando (β-NGF) fue identificado a nivel de los PCs. La presencia de este receptor a nivel de este OCV no ha sido documentada previamente y en esta especie podría constituir una vía para el transporte de esta neurotrofina al ambiente ventricular. Finalmente, β-NGF and fibras GnRH, fueron identificados en la región del OVLT, lo que también abre la posibilidad de que este sea otro sitio donde esta neurotrofina podría efectuar una señalización para estimular el inicio de la cascada ovulatoria. Basados en los resultados de esta investigación, podemos concluir que la ovulación es inducida después del depósito del plasma seminal en el útero durante la cópula en llamas. El principal responsable del desencadenamiento de la cascada ovulatoria sería el β-NGF contenido en el plasma seminal, que una vez incorporado en la sangre después de la cópula podría llegar a sitios potenciales de acción entrando en la región del hipotálamo medio basal, a través de los plexo Coroides o eminencia media, ó señalizando de manera directa a las neuronas GnRH a nivel del OVLT. Palabras clave: Factor inductor de la ovulación, β-NGF, trkA Hipotálamo, Hipófisis, órganos circunventriculares, llamas.